【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】冷凍電子斷層成像(cryo-electron tomography,cryoET)技術(shù)、冷凍聚焦離子束(cryo-focused ion beam,cryoFIB)樣品減薄技術(shù)和子斷層平均技術(shù)(sub-tomogram averaging,STA)的進(jìn)步推動(dòng)了生物大分子在細(xì)胞中的原位結(jié)構(gòu)測(cè)定，對(duì)于研究膜蛋白結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞環(huán)境中的相互作用具有重要意義。斷層掃描圖像(tomogram)是三維圖像，但由于低信噪比和細(xì)胞內(nèi)擁擠的環(huán)境，當(dāng)前的觀察方法仍主要依賴查看tomogram中的二維截面。然而，細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)通常呈彎曲形態(tài)，這使得通過(guò)二維截面難以直接觀察膜表面蛋白的分布。同時(shí)，膜信號(hào)強(qiáng)烈的襯度也會(huì)干擾膜蛋白的識(shí)別，增加原位觀察和結(jié)構(gòu)解析的難度。
 

　　近日，清華大學(xué)生命學(xué)院李雪明副教授課題組在《自然·通訊》(Nature Communications)在線發(fā)表題為“MPicker：冷凍電子斷層成像中膜蛋白的可視化與挑選”(MPicker:visualizing and picking membrane proteins for cryo-electron tomography)的研究論文。該論文報(bào)道了一種基于“膜展平”的方法，通過(guò)在“展平tomogram”中進(jìn)行操作來(lái)降低膜蛋白可視化與挑選的難度(圖1)。該方法首先通過(guò)膜分割或者手動(dòng)標(biāo)注定位感興趣區(qū)域(一片膜)，然后在tomogram中對(duì)這片膜及其周?chē)膮^(qū)域進(jìn)行變形處理，最終把這個(gè)局部區(qū)域展平為一個(gè)包含平整膜結(jié)構(gòu)的新tomogram，也就是展平tomogram。在這個(gè)新生成的展平tomogram中，原本彎曲的膜會(huì)變成一個(gè)平板，膜厚度與蛋白取向局部保持不變。展平tomogram中每一層二維截面都對(duì)應(yīng)一個(gè)平行于膜的等距面，使得膜表面的蛋白信號(hào)可以輕易地以二維圖像的形式被展示。這起到了降維的效果，降低了膜蛋白分析的空間復(fù)雜性，改善了膜上和膜周?chē)鞍踪|(zhì)的可視化效果。
 

圖1.MPicker軟件流程圖
 

　　基于膜展平方法，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了名為MPicker的新軟件，該軟件能夠在多種細(xì)胞切片樣品的tomogram中清晰展示膜表面的蛋白分布(圖2)。在展平tomogram中，用戶可以更方便地識(shí)別并挑選顆粒。為了提高自動(dòng)化程度，MPicker還整合了EPicker軟件(一款原本用于單顆粒圖像的自動(dòng)顆粒挑選工具)，充分利用了展平tomogram二維化的優(yōu)勢(shì)。除了在MPicker中進(jìn)行操作，用戶也可以靈活地使用其他軟件在展平tomogram中進(jìn)行顆粒挑選。
 

圖2.使用MPicker對(duì)類(lèi)囊體膜進(jìn)行展平
 

　　MPicker還可以提供每個(gè)顆粒的初始取向用于輔助膜蛋白STA的計(jì)算。除了常規(guī)的膜法向量，用戶還可以方便地通過(guò)MPicker在展平tomogram中標(biāo)注蛋白在膜表面的面內(nèi)取向，從而利用更強(qiáng)的角度約束來(lái)輔助STA的計(jì)算。為提高取向確定的自動(dòng)化程度，研究團(tuán)隊(duì)將膜蛋白沿膜法向量投影，并進(jìn)行了改造的二維分類(lèi)，從而更高效地獲得每個(gè)顆粒的精準(zhǔn)取向信息。通過(guò)這一方法，團(tuán)隊(duì)使用四套tomogram數(shù)據(jù)成功解析了衣藻PSII-LHCII超復(fù)合物的低分辨原位結(jié)構(gòu)(圖3)，并將結(jié)果上傳至EMDB數(shù)據(jù)庫(kù)(EMD-61019)。
 

圖3.通過(guò)膜蛋白的法向量和面內(nèi)角約束STA的計(jì)算
 

　　生命學(xué)院李雪明副教授為論文的通訊作者，生命學(xué)院2020級(jí)博士生顏嘯峰為論文的第一作者。電子系李樹(shù)東、黃煒琳，生命學(xué)院王皓博士(已畢業(yè))，電子系趙天放、黃銘濤，冷凍電鏡平臺(tái)周昵昀博士，以及電子系沈淵教授為本研究作出了重要貢獻(xiàn)。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金委、生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心等的資金支持，并得到國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究(北京)設(shè)施清華基地的技術(shù)支持。