分離效率和靈敏度較差，保守的分析方法的干擾因素較多。而采用的此法可在5min內(nèi)同時測定糖尿病腎病尿樣中的CnCrU和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物.此方法具有快速、需樣量小、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，*可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測。

流動相含30％（體積比）甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸緩沖溶液，摘要】目的建立糖尿病患者尿液中與腎病相關(guān)的非蛋白氮代謝產(chǎn)物（肌酸、肌酐、尿素和尿酸）反相液相色譜分離分析方法.方法：采用AgilentC18200mm4.6mm內(nèi)徑5μm色譜柱。流速0.9mL/min檢測波長200nm柱溫為室溫.結(jié)果：5min內(nèi)可對患者尿液中上述4種物質(zhì)同時進行測定，樣品前處理簡單，重現(xiàn)性較好（遷移時間和峰面積的RSD均≤3%線性范圍較寬（肌酸：5~300μmol/L肌酐：10~200μmol/L尿素：1~30mmol/L尿酸：10~1500μmol/L.結(jié)論：此法*適用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測。

關(guān)鍵詞】反相液相色譜；糖尿病腎??；非蛋白氮；尿樣

引言

已引起了人們廣泛關(guān)注.非蛋白氮代謝產(chǎn)物如肌酸（creatinCr肌酐（creatininCn尿素（ureaU和尿酸（uricacidUa即是與DN相關(guān)的幾種物質(zhì).已報道的有關(guān)這些物質(zhì)的分離分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色譜法［3-6］、毛細管電泳法［7-9］等.其中比色法和酶法通常只能測定單一的物質(zhì)，糖尿病并發(fā)腎?。╠iabeticnephropathiDN糖尿病患者致死的重要原因之一。而且尿液中的一些內(nèi)源性物質(zhì)對測定有干擾；液相色譜法則多集中在對某一種或部分物質(zhì)的測定上；毛細管電泳測定這些標志物重現(xiàn)性有待于提高.運用反相液相色譜法，對DN患者尿液中與DN相關(guān)的CrCnU和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物進行同時分離檢測.同時測定尿液中的4種物質(zhì)目前還未見報道.此法具有快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，*可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測.

1資料和方法

水為二次重蒸水1.1資料Agilent1100液相色譜儀（美國Agilent公司）CrCnUa均購自Sigma公司（USASigma甲醇為色譜純試劑（天津第二化學(xué)試劑廠）其余試劑均為分析純。.

1.2方法

等度洗脫，1.2.1色譜條件色譜柱為AgilentC18柱（200mm4.6mm內(nèi)徑5μm流動相含體積比為30%甲醇和10mmol/LpH6.86磷酸緩沖溶液。流速0.9mL/min檢測波長200nm柱溫為室溫，進樣量為10μL.

溶解在40mL重蒸水中，1.2.2規(guī)范溶液的配置和尿樣的處置方法CrCn和U規(guī)范溶液均使用二次重蒸水配置成一定的濃度.Ua溶液的配置方法如下：取30mg磷酸鉀。加熱至60℃，使其*溶解，稱取Ua28mg溶解于熱磷酸鉀溶液中，冷卻至室溫，移入100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，貯存在棕色瓶中保存.尿液樣品的處置方法：取新鮮的尿液用水稀釋1倍后待用.所有溶液每周更換1次，使用前均過0.45μm水相膜后再用于色譜分析.

2結(jié)果

分別改變緩沖液的pH值、流動相（pH6.86中甲醇比例、流動相中緩沖液濃度和流動相的流速，2.1色譜條件的優(yōu)化固定其它色譜條件不變?？疾炝似鋵?種物質(zhì)分離的影響。

連續(xù)5次測定了同一樣品，2.2方法重現(xiàn)性在選定的色譜條件下。對各物質(zhì)的遷移時間、峰面積和峰高的重現(xiàn)性進行了考察，結(jié)果標明，各物質(zhì)的遷移時間的變化很小（保管時間的RSD值見表1方法的重現(xiàn)性較好。

按上述色譜條件進行分析測定，2.3定量規(guī)范曲線、回收率以及zui低檢測限配置一系列濃度的規(guī)范溶液。將所測的峰面積對物質(zhì)的濃度作回歸分析，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9992以信噪比（S/N為3來測定檢測限；

對規(guī)范溶液和實際DN尿樣進行了分析，2.4樣品分析在選定的色譜條件下。5min內(nèi)4種物質(zhì)即可達到*分離，分離結(jié)果如圖3所示，實際DN尿樣中的4種物質(zhì)得到很好的檢出，尿樣里的其他物質(zhì)對分析無干擾.采用此法對某糖尿病患者以及正常人尿樣中的CnCrUUa分別進行測定，結(jié)果糖尿病患者尿樣中CnCrUUa含量分別為10.30.6826.72.1μmol/mL正常人尿樣中的CnUUa含量分別為7.736.71.0μmol/mL而Cr未被檢出。

3討論

pH3.5~7.5范圍內(nèi)U和Cr出峰時間和順序幾乎不隨pH變化而變化；而對于Cn和Ua來說，3.1pH對分離的影響其從圖1A中可以看出。其出峰時間和順序都隨pH變化而變化，當(dāng)pH接近5.5時，兩者的出峰時間近乎相同，得不到分離.因此，選擇*pH時，主要考慮Cn和Ua之間的分離度（Rs以及分析的效率（分析周期短）zui終選擇緩沖能力zui強，分離度較佳（Rs＝4.1pH6.86為優(yōu)化的分離pH

隨著流動相中甲醇比例的增加，3.2流動相中甲醇比例的選擇從圖1B中可以看出。各標志物的出峰時間隨之減少，分離周期大大縮短，但與此同時各標志物間的分離度也相應(yīng)減少，當(dāng)流動相中甲醇的比例大于40％時，各物質(zhì)幾乎同時被洗脫出來，難以達到分離.zui終選擇流動相中甲醇含量為30％為較佳的比例（此時分析周期較短，各物質(zhì)間分離度均大于2.0

隨著緩沖液濃度的增加，3.3流動相中緩沖液濃度對分離的影響從圖2A中可以看出。各標志物的峰面積隨之減小.而緩沖液濃度為5和10mmol/L時峰面積比較接近，zui終選擇緩沖能力較強的10mmol/L為*緩沖液濃度。

各物質(zhì)間的分離度是逐漸增加的并且分析周期變短；而當(dāng)流速從0.9mL/min增加到1.0mL/min后，3.4當(dāng)流速從0.4mL/min增加到0.9mL/min時。雖然分析效率有所提高（分離周期從4.8min減少到4.0min但各物質(zhì)間的分離度卻有所減?。ù藭r的柱壓也過高：93.1bar.zui終選擇0.9mL/min為*流速。

CnCr和Ua糖尿病患者尿樣中的含量高于正常人（患者尿樣中Cr含量遠遠高于正常人尿液中Cr含量）而患者尿樣中U含量反而有所降低.這些都說明患者腎功能已經(jīng)出現(xiàn)異常，3.5測定結(jié)果的分析從某糖尿病患者以及正常人尿樣測定的結(jié)果可以看出。非蛋白氮代謝產(chǎn)物不能很好的排出體外（對Cr排泄率增加，而U排泄率降低）這也從一個側(cè)面證實了患者的腎臟已經(jīng)有了一定水平的損壞。